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寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基與胰酪大豆胨瓊脂或肉湯在不同儲(chǔ)存溫度和培養(yǎng)條件下回收洋蔥伯克霍爾德氏菌的比較
2024-05-18 15:05:17
洋蔥伯克霍爾德氏菌復(fù)合體（BCC）能夠在低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境和惡劣條件下保持存活，對(duì)非無(wú)菌藥品構(gòu)成污染風(fēng)險(xiǎn)，且難以檢測(cè)。BCC分離株是污染無(wú)菌和非無(wú)菌藥品的一些最常見的微生物，最近爆發(fā)的幾次感染與被發(fā)現(xiàn)的含有BCC的防腐劑有關(guān)。含水產(chǎn)品尤其危險(xiǎn)，因?yàn)?/span>BCC能夠在惡劣條件下保持活力，包括防腐劑的存在。本研究的目的是評(píng)估使用寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的BCC，與使用TSA或TSB在不同的無(wú)菌蒸餾水樣品中保存溫度以及不同的防腐劑濃度下的恢復(fù)情況，并進(jìn)行比較。因此推薦這篇文章給大家，希望能對(duì)大家有所幫助。
Oligotrophic Media Compared with a Tryptic Soy Agar or Broth for the Recovery of Burkholderia cepacia Complex from Different Storage Temperatures and Culture Conditions
內(nèi)容
摘要：洋蔥伯克霍爾德氏菌菌群（BCC）能夠在低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境和惡劣條件下保持存活，對(duì)非無(wú)菌藥品構(gòu)成污染風(fēng)險(xiǎn)，并對(duì)檢測(cè)構(gòu)成挑戰(zhàn)。為了建立檢測(cè)BCC的最佳回收方法，我們對(duì)三種寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基從高壓蒸餾水或防腐溶液中回收BCC進(jìn)行了比較。將20株BCC菌株連續(xù)稀釋后（10-1~10-12 CFU/ml）接種到高壓蒸餾水中，在6℃、23℃和42℃條件下保存42天。用6種洋蔥伯克霍爾德氏菌懸液接種含5 μg/ml和50 μg/ml氯己定葡萄糖酸酯（CHX）和10 μg/ml苯扎氯銨（BZK）的水溶液，并在23℃再儲(chǔ)存199天。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，如胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）或胰蛋白酶大豆肉湯（TSB），少營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(1/10強(qiáng)度的TSA或TSB，R2A或R2AB，和1/3強(qiáng)度R2A或R2AB，使用這些培養(yǎng)基接種從高壓蒸餾水和防腐樣品的BCC。液體培養(yǎng)基中BCC（水中或防腐劑中）的回收率高于固體培養(yǎng)基。寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)20株BCC樣品的回收效率高于TSA或TSB。多重比較的結(jié)果使我們能夠直接識(shí)別TSA或TSB與寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基之間的顯著差異。美國(guó)藥典（USP）提出的BCC檢測(cè)的簡(jiǎn)單檢測(cè)方法提供了一種寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基預(yù)富集復(fù)蘇步驟。
材料和方法：
寡培養(yǎng)基的制備：
結(jié)果：
不同儲(chǔ)存溫度下TSB和R2AB的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)：為了了解溫度對(duì)存活的影響，將20株BCC在3種溫度（6℃、23℃和42℃）下保存42天，并在不同的培養(yǎng)基中恢復(fù)。綜合結(jié)果，在6℃、23℃和42℃下觀察到存活，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)物種特異性的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)基接種初始濃度為102-100 CFU/ml（在蒸餾水6℃和23℃保存42天），108-106 CFU/ml（在蒸餾水42°C保存42天時(shí)），觀察到洋蔥AU19236的生長(zhǎng)。在TSB、1/10×TSB、R2AB和1/3×R2AB中觀察了AU19236在30℃培養(yǎng)24 h后的生長(zhǎng)，并使用Baranyi模型描述了動(dòng)力學(xué)。接種TSB、1/10×TSB、R2AB和1/3×R2AB的AU19236擬合的生長(zhǎng)曲線平均r2值為> 0.98。由于回歸線與觀測(cè)數(shù)據(jù)點(diǎn)近似，因此在平均生長(zhǎng)曲線中得到了較高的r2值。在6℃保存的蒸餾水中培養(yǎng)，顯示出更長(zhǎng)的滯后時(shí)間（λ），范圍在17.6-27.4h之間（圖1A）。在23℃和42℃（分別為10.1和14.2h）下估計(jì)的滯后時(shí)間沒(méi)有顯著差異（1B和1C）。在6℃和23℃時(shí)，1/10×TSB、R2AB和1/3×R2AB的滯后時(shí)間值（λ）大于TSB，但在42℃時(shí)，滯后時(shí)間值不大。此外，無(wú)論使用何種培養(yǎng)基生長(zhǎng)速度(μ)沒(méi)有顯著差異（p > 0.05），盡管寡營(yíng)養(yǎng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基（如1/10×TSB,R2AB和1/3×R2AB在23℃和42℃）增長(zhǎng)率更大。
不同儲(chǔ)存溫度下TSA與寡營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基比較：為了評(píng)估固體培養(yǎng)基中的活菌落計(jì)數(shù)，使用ProtoCOL3自動(dòng)平板計(jì)數(shù)器對(duì)每個(gè)平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。
經(jīng)過(guò)42天的培養(yǎng)，在6°C（104-108 CFU/ml）和23°C（107-1012 CFU/ml）的濃度下，所有的瓊脂都很容易恢復(fù)。然而，在42°C（102-106 CFU/ml）的蒸餾水中當(dāng)20株BCC菌株被接種在固體培養(yǎng)基上時(shí)，只有8株BCC菌株42天后生長(zhǎng)。其余菌株培養(yǎng)9天后沒(méi)有在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
在6°C儲(chǔ)存42天后，所有瓊脂的回收率約為104 -108 CFU/ml。B. lata HI4002，B. cenocepacia HI2976 和 B. cenocepacia HI2485 為BCC菌株，菌落計(jì)數(shù)較高，達(dá)到108 CFU/ml。1/3×R2A（1.79 ± 6.81×108 CFU/ml）和R2A（1.95 ± 7.31×108 CFU/ml）的菌落計(jì)數(shù)略高于TSA（1.67 ± 6.41×108 CFU/ml）的菌落計(jì)數(shù)。采用Mann-Whitney Rank Sum Test比較TSA與1/10×TSA、1/3×R2A和R2A之間的差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）。在23°C的蒸餾水中，在各種培養(yǎng)基上，1012 CFU/ml BCC的初始濃度保持不變。1/10×TSA（4.18 ± 6.17×1012 CFU/ml）、1/13×R2A（4.17 ± 5.62×1012 CFU/ml）和R2A（4.46 ± 5.78×1012 CFU/ml）的菌落計(jì)數(shù)均高于TSA（3.44 ± 5.09×1012 CFU/ml）。采用Mann-Whitney Rank Sum Test比較TSA與R2A的差異，發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.041）。
在42°C時(shí)，只有8株菌株生長(zhǎng)到約105 CFU/ml。1/10×TSA（2.01 ± 4.17×105 CFU/ml）、1/3×R2A（6.56 ± 15.05×105 CFU/ml）和R2A（6.53 ± 14.72×105 CFU/ml）的菌落數(shù)量比TSA（0.57±1.39±1.39×105 CFU/ml）更高。采用Mann-Whitney Rank Sum Test比較TSA與寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的差異，如1/10×TSA（p = 0.008）、1/3×R2A（p < 0.001）和R2A（p < 0.001）。
不同儲(chǔ)存溫度下TSB和寡營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的比較：對(duì)TSB、1/10×TSB、1/3×R2AB和R2AB肉湯培養(yǎng)基在6°C、23°C和42°C下恢復(fù)BCC的能力進(jìn)行了評(píng)估。
在6°C存儲(chǔ)時(shí)，與1/10×TSB、1/3×R2AB和R2AB相比，TSB介質(zhì)中的回收效率較低，回收率分別為351/480（回收次數(shù)/測(cè)試次數(shù)）、345/480和353/480。對(duì)接種的菌落數(shù)最低（10-12）的4個(gè)肉湯的評(píng)價(jià)表明，1/10×TSB、1/3×R2AB和R2AB支持從23°C存儲(chǔ)中回收BCC。在480次試驗(yàn)中，分別有39、94、94、107、79個(gè)TSB、1/10×TSB、1/3×R2AB和R2AB培養(yǎng)基中BCC的回收率存在差異。統(tǒng)計(jì)分析顯示，TSB的有效性低于1/10×TSB。
CHX和BZK的恢復(fù)
TSA和稀釋固體培養(yǎng)基在不同濃度的防腐劑下的比較：將6株菌株懸浮在5和50 μg/ml CHX或10 μg/ml BZK中。在5和50 μg/ml的CHX溶液中，1/10×TSA（7.06 ± 6.5×104 CFU/ml，3.73 ± 3.93×103 CFU/ml）的菌落計(jì)數(shù)略高于TSA（6.59 ± 5.12×104 CFU/ml，3.03 ± 3.42×103 CFU/ml），分別如下圖：
采用Mann-Whitney Rank Sum Test比較TSA與1/10×TSA的差異，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p < 0.05)。此外，在10 μg/mlBZK溶液中，1/10×TSA（1.51 ± 1.77×103 CFU/ml）、1/3×R2A（1.58 ± 1.73×103 CFU/ml）、R2A（129±2.24×103 CFU/ml）的菌株數(shù)量分別略高于TSA（1.27 ± 1.28×103 CFU/ml）。
不同濃度防腐劑下TSB和少營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的比較：對(duì)TSB、1/10×TSB、1/3×R2AB和R2AB肉湯培養(yǎng)基在5和50 μg/ml CHX或10 μg/ml BZK中恢復(fù)BCC的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。在R2AB介質(zhì)中恢復(fù)效率更高，恢復(fù)數(shù)量分別為134/144（恢復(fù)次數(shù)/試驗(yàn)次數(shù)，從5 μg/ml of CHX）、114/144（50 μg/ml of CHX）和113/144（10 μg/ml of BZK）。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析顯示，TSB和R2AB的CHX的5μg/ml（χ2統(tǒng)計(jì)= 6.9231，p = 0.0085）、50 μg/ml的CHX（χ2統(tǒng)計(jì)= 9.8223，p = 0.0017）和10 μg/ml的BZK（χ2統(tǒng)計(jì)= 31.3481，p < 0.05）之間存在顯著差異。
討論：
洋蔥伯克霍爾德氏菌復(fù)合體（BCC）能夠在低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境和惡劣條件下保持存活，對(duì)非無(wú)菌藥品構(gòu)成污染風(fēng)險(xiǎn)，并對(duì)檢測(cè)構(gòu)成挑戰(zhàn)。為了建立檢測(cè)BCC的最佳回收方法，作者對(duì)三種寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并與營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基從高壓蒸餾水或防腐溶液中回收BCC進(jìn)行了比較。將20株BCC菌株連續(xù)稀釋后（10-1~10-12 CFU/ml）接種到高壓蒸餾水中，在6℃、23℃和42℃條件下保存42天。用6種洋蔥伯克霍爾德氏菌懸液接種含5 μg/ml和50 μg/ml氯己定葡萄糖酸酯（CHX）和10 μg/ml苯扎氯銨（BZK）的水溶液，并在23℃再儲(chǔ)存199天。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，如胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）或胰蛋白酶大豆肉湯（TSB），少營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(1/10強(qiáng)度的TSA或TSB，R2A或R2AB，和1/3強(qiáng)度R2A或R2AB)通過(guò)接種高壓蒸餾水和防腐樣品的BCC到培養(yǎng)基中。肉湯培養(yǎng)基中水中或防腐劑中BCC的回收率高于固體培養(yǎng)基。寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)20BCC樣品的回收效率高于TSA或TSB。多重比較的結(jié)果使我們能夠直接識(shí)別TSA或TSB與寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基之間的顯著差異。
