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從廢水中選擇性分離空腸彎曲桿菌的一種改良培養(yǎng)方法
2024-06-24 17:01:56
彎曲桿菌是引起食源性感染的主要細(xì)菌原因，是從環(huán)境來源（如湖泊、河流、海洋和污水）中分離出來的，這表明環(huán)境水是將彎曲桿菌傳播給人類的可能載體。然而，分離與水傳播暴發(fā)有關(guān)的彎曲桿菌似乎具有挑戰(zhàn)性，這不僅是由于從環(huán)境和糞便樣本中分離出來的彎曲桿菌的可培養(yǎng)能力迅速喪失，也由于最初的感染和暴發(fā)調(diào)查之間的時(shí)間間隔。因此，采用基于培養(yǎng)的方法對(duì)水資源進(jìn)行定期監(jiān)測系統(tǒng)可能會(huì)低估彎曲桿菌在環(huán)境中的流行率，這可能會(huì)誤導(dǎo)我們對(duì)環(huán)境源在人類感染中所發(fā)揮的作用的理解和彎曲桿菌對(duì)食物鏈的污染的可能。為此推薦本篇文章與大家一起學(xué)習(xí)，希望能對(duì)大家有所幫助。
內(nèi)容
1.摘要
空腸彎曲桿菌是世界范圍內(nèi)主要的食源性致病菌之一，廣泛存在于多種食物、家畜、野生動(dòng)物和環(huán)境中。目前可用的基于培養(yǎng)的分離方法對(duì)廢水樣品不是很有效，因?yàn)樵诟偁幖?xì)菌中空腸梭菌的數(shù)量很少。為了從廢水樣品中檢測和分離空腸彎曲桿菌，本研究使用五種不同的抗生素（如頭孢哌酮、萬古霉素、甲氧芐氨嘧啶、多粘菌素B和利福平）評(píng)估了幾種不同的富集條件，空腸彎曲桿菌對(duì)此具有內(nèi)在耐藥性。用qRT-PCR檢測Ct值測定各富集條件的選擇性和多重PCR檢測彎曲桿菌的種類。此外，通過在Bolton和Preston 瓊脂平板上生長來考察彎曲桿菌在不同培養(yǎng)基上選擇性富集后的分離效果。在Bolton選擇性補(bǔ)充劑中添加多粘菌素 B、利福平或兩者均可增強(qiáng)空腸彎曲桿菌的選擇性分離，16S rDNA測序結(jié)果顯示，腸球菌屬和銅綠假單胞菌是富集條件下的主要競爭細(xì)菌。雖然已知很難從重污染的樣品中分離出彎曲桿菌，但本研究很好地表明，抗生素選擇的處理可以提高從廢水中分離苛養(yǎng)型的彎曲桿菌的效率。
2. 結(jié)果與討論
空腸彎曲桿菌在不同抗生素補(bǔ)充劑下的生長：
Bolton選擇性補(bǔ)充劑（BN）由三種抗生素組成，包括頭孢哌酮、萬古霉素和甲氧芐啶，在實(shí)驗(yàn)中，BN作為基礎(chǔ)抗菌補(bǔ)充劑，在BN中添加多粘菌素B、利福平或兩者以增加抗生素選擇壓力。
在BN中加入多粘菌素B或利福平均不影響生長。在12 h時(shí)，同時(shí)添加利福平和多粘菌素B可略微降低OD600；然而，在四種不同的富集條件下，生長沒有顯著差異(圖1)。結(jié)果表明，空腸彎曲桿菌可以在天然耐藥的多種抗生素聯(lián)合存在的情況下生長。
不同富集條件下qRT-PCR檢測彎曲桿菌的Ct值:
qRT-PCR檢測彎曲桿菌的Ct值隨抗菌富集程度的不同而變化。添加一種抗生素(即利福平或多粘菌素B)顯著降低了Ct值，說明彎曲桿菌的數(shù)量因選擇性富集而增加。此外，與其他富集條件相比，添加兩種抗生素的Ct值最低(圖2)，表明抗生素選擇壓力的增加增強(qiáng)了原始污水樣品中彎曲桿菌的富集。
不同富集條件下彎曲桿菌的多重PCR檢測：
TABLE 1 | The number of positive detection of Campylobacter 16S rDNA,
C. jejuni, C. coli, and C. lari with multiplex PCR in four different enrichment conditions at 42?C.
多重PCR結(jié)果顯示，原發(fā)彎曲桿菌屬為空腸彎曲桿菌和大腸桿菌(表1)。與多粘菌素b相比，添加利福平檢測空腸彎曲桿菌和大腸桿菌的頻率更高。
增加抗生素選擇壓力來增強(qiáng)從原始污水中分離出的彎曲桿菌：
為了檢查瓊脂培養(yǎng)基對(duì)彎曲桿菌分離的影響，我們將富集培養(yǎng)物接種在彎曲桿菌的常見培養(yǎng)基 Bolton 和 Preston 瓊脂上。與qRT-PCR結(jié)果一致，添加利福平、多粘菌素B和兩種抗生素可顯著提高彎曲桿菌的分離頻率，降低非彎曲桿菌的分離頻率（圖3）。其中，BNRP對(duì)彎曲桿菌的分離率最高，而BN沒有恢復(fù)任何彎曲桿菌。
雖然抗生素富集顯著影響分離頻率，但 Bolton 和 Preston 瓊脂培養(yǎng)基在分離頻率上沒有任何差異。
為了鑒定在選擇性富集培養(yǎng)基上生長的主要非彎曲桿菌群體，我們根據(jù)菌落形態(tài)隨機(jī)選擇了100個(gè)菌落，并進(jìn)行了16S rDNA擴(kuò)增子測序。主要的非彎曲桿菌屬包括腸球菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌、變形桿菌和假單胞菌（表2）。補(bǔ)充額外的抗生素，無論是單一的(即BNR和BNP)還是兩者(即BNPR)，都抑制了其他細(xì)菌種群的生長，然而，在BNPR中仍然分離到腸球菌。重要的是，增加了抗生素的選擇壓力提高了從廢水中分離出彎曲桿菌的頻率。
討論：
研究發(fā)現(xiàn)增加抗生素選擇壓力和培養(yǎng)溫度是影響影響從嚴(yán)重污染廢水樣品中成功分離空腸衣原體的關(guān)鍵參數(shù)。此外，利福平似乎可以有效地提高基于PCR的定量方法中彎曲桿菌富集的選擇性，而利福平和多粘菌素B都需要抑制競爭性細(xì)菌的生長，并通過基于培養(yǎng)的方法提高對(duì)空腸彎曲桿菌分離的選擇性。
